Hwang, Kim, Kim, and Lee: Skin sensitization test of potassium hydroxide in guinea pigs

Abstract

This study was to evaluate the skin sensitization of potassium hydroxide (KOH) by the guinea pig maximization test. In the preliminary test, the induction and challenge dose of KOH were determined as 1.0 and 0.2%, respectively. Guinea pigs were sensitized with intradermal injection of 0.1ml KOH for 24 h. After 1 week, 1.0% of KOH was treated on the site of injection and 0.2% of KOH was challenged 2 weeks later. The average skin reaction evaluated by erythema and edema on the challenge sites and sensitization rate in the KOH-treatment group at 24 h were 0.0 and 0%, respectively, which are substantially low compared with in the 2,4-dinitrochlorobenzene-treatment group (positive control group) (average skin reaction: 3.0, sensitization rate: 100%) and identical with in the distilled water-treatment group (negative control group), representing a weak sensitizing potential. The average skin reaction and sensitization rate observed at 48 h were 0.0 and 0% in the KOH-treatment group, respectively, and 2.0 and 100% in the positive control group, respectively. It was concluded that 1.0% of KOH classified to Grade I, induced no sensitization when tested in guinea pigs.

서 론

식품을 다루는 식품관련 산업현장에서 사용하는 기구와 장비는 식품과 접촉하기 때문에 위생적으로 관리되어야 한다. 앞선 연구들 에서, 식육가공과정에서 기구, 장비 혹은 원료육에 오염되어 생물막 을 형성하는 균들에는 Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens 등이 있는 것으로 보고되었다 [4, 13, 15]. 이러한 균들은 식중독을 유발하는 미생물들로 기구와 장비 가 오염되게 되면, 식품으로 교차오염이 일어날 수 있으므로 건강상 에 문제를 일으킬 수 있다 [10].
식품산업현장에서는 미생물로 인한 위해를 최소화하기 위해 다양한 종류의 살균소독제들이 사용되고 있는데, 이들 산균소독 제들은 산화제, 표면 활성 화합물, 요오드화합물 등 광범위하게 분류할 수 있다 [17]. 식품산업에서 광범위하게 사용되고 있는 산화제 계통의 살균소독제에는 할로겐 기반 화합물, 과초산, 오 존, 과산화수소 등이 있으며 [7], 표면 활성 화합물에 속하는 산성 음이온 화합물과 4급 암모늄 화합물들이 식품산업에서 가장 많 이 사용되고 있다 [7]. 최근, 국내 식품제조?가공업체에서 사용 하고 있는 살균소독제에 대한 설문조사 결과 [10], 에탄올계 제 품을 가장 많이 사용하고 있었으며, 두번째로 염소 함유 제품들 이 많이 사용되고 있었다고 조사된 바 있다.
국민들의 식품위생에 대한 의식이 증가하면서, 식물 추출물, 유기산, 식품첨가물 등과 같은 식품 등급 항균물질들이 안전성과 무독성으로 인해 기존 합성 화합물 기반의 소독제를 대체하기 위한 효과적인 대안으로 주목을 받고 있다 [12]. 생강추출물을 이용한 손소독제 연구 [6], 유카추출물을 이용한 살균소독제 연 구 [14], 약초 추출물 혼합 가정용 수세미 살균소독제 연구 [11] 등이 진행되었다. 하지만, 일부 천연물의 경우 강한 약리작용 및 유독성 등으로 인하여 안전성 및 건전성이 입증되지 않았으며, 대부분의 천연물들은 항균활성이 미약하거나 좁은 항균스펙트 럼, 제형상의 문제점 등으로 인하여 제품으로 상용화 된 경우는 그리 많지 않은 실정이다 [8, 18]. 따라서 미국 식품의약품안전청 에서 ‘일반적으로 안전한 물질(Generally recognized as safe, GRAS)’로 인정한 유기산 [9, 12]과 수산화칼슘 [1] 등과 같은 식품 첨가물을 이용한 소독제 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 수산 화 칼륨(KOH)은 식품의 경화제, 산도 조절제, 안정제 등으로 사용 되는 식품첨가물로, 미국 식품의약품안전청에서 GRAS로 인정된 물질이다 [4]. 앞선 연구에서 [1], 가금육의 표면에 여러 식중독균 을 오염시킨 후, 0.75%의 KOH로 세척한 결과, Campylobacter jejuni, Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa 등이 검출되지 않았다고 보고하였다. 또한, 다른 연구에서 [16], 치과용 드릴에 대한 멸균효과를 0.5-1.0% KOH와 1.0-2.0% glutaldehyde를 비 교한 결과, KOH가 보다 효과적이었다고 보고하였다.
본 연구에서는, 식품첨가제로서 살균소독제로 사용되는 KOH 의 사용과정에서 피부에 미치는 영향을 평가하기 위해, 농림축산 검역본부 고시 제2016-22호 ‘동물용의약품등 독성시험지침’ [2] 에 따라 기니픽을 이용하여 피부 감작성 시험을 수행하였다.

재료 및 방법

시험 물질

KOH 10%를 함유한 소독제를 ㈜카브 (Seoul, Korea)에서 제공받아, 시험에 사용 전까지 실온에 보관하였다. 2,4-dinitrochlorobenzene (DCNB), Freund's complete adjuvant (FCA) 등은 ㈜한국 머크 (Seoul, Korea)에서 구입하였다.

실험동물

5주령의 수컷 36마리 기니픽 (Dunkin-Harley) (체중, 300?350g) 을 ㈜샘타코바이오코리아 (Osan, Korea)로부터 구입하여 실험에 사용 하였다. 입수한 실험동물들은 육안검사를 한 후에 온도 23 ± 2℃, 상대습 도 55 ± 10%, 조명시간 12 시간 (오전 7시?오후 7시), 조도 200?300 Lux의 환경조건에서 멸균된 음용수와 0.01% 비타민 C가 함유된 기니픽 용 고형사료 (Harlan Teklad, USA)를 자유 급여 하였으며, 환기는 자동 으로 조절되는 실험동물 사육장치 (Three-Shine Inc., Daejeon)에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 경상대학교 동물실험윤리위원회의 승인 을 받아 연구윤리지침에 따라 진행하였다 (GNU-200316-G0012).

피부 감작성 시험

예비시험을 통해 감작 및 항원야기량을 결정하기 위해, 증류 수로 희석한 KOH 용액 (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125%)을 농도 별로 2×4 cm로 제모한 2마리 기니픽 등에 0.1 ml씩 좌우대칭이 되도록 피내주사 하였다. 피내주사 24시간 후에 주사 부위를 관 찰하여 모든 동물에서 피부 괴사가 나타나지 않은 최고 농도를 감작항원량으로 설정하였다. 1 주일 후, 증류수로 희석한 KOH 용액 (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125%)을 2마리 기니픽의 제모된 측복부에 각각의 시험물질 희석액 0.2 ml을 함유한 패취 (1×1 cm)를 부착하여 24시간 폐색첩포하였다. 패취 제거 후 24시간 및 48시간째에 관찰하여 홍반이 나타나지 않는 최대 농도를 야 기항원량으로 설정하였다.
본 시험을 위해, 기니픽 5마리씩을 1군으로 하여, 용매대조군 (증류수), 양성대조군 (DCNB), KOH 용액 투여군으로 구성하여 실험을 수행하였다. KOH 용액 투여군은 예비시험에서 결정한 감작항원량을 사용하였다. 시험 개시 전 기니픽의 등을 상처가 나지 않도록 4×4 cm의 크기로 전기제모기와 면도기를 이용하여 털을 제거하였다. 1차 감작노출을 위해, 제모한 기니픽의 등 부위 피부 (2×4 cm)에 Fig. 1과 같이 3종의 시료 (① 생리식염수/FCA (1:1, v/v) 유화물, ② 증류수 ③ 증류수로 희석한 KOH 용액 + ① (1:1, v/v))를 각각 좌우 대칭으로 0.1 ml씩 피내주사 하였다. 1차 감작 1주 후 피내주사한 부위를 다시 제모한 뒤 각 시험군별로 해당물질을 함유한 패취 (patch, 2×2 cm)를 Fig. 1과 같이 부착하여 48시간 동안 폐색첩포 시켰다. 감작 야기를 위해, 폐색첩포 2주 후, 시험동물의 측복부를 제모하고 각 시험군 별로 해당물질을 함유한 패취 (patch, 2×2 cm)를 부착하여 24 시간과 48시간 동안 폐색첩포하여 감작을 야기시켰다. 다른 한 쪽에는 용매대조군의 용매인 증류수를 적용하였다.
Fig. 1.
Induction of skin sensitization and skin reaction in guinea pig. ①, intradermal injection of 0.1 ml saline + Freund's complete adjuvant (FCA) emulsion (1:1, v/v); ②, intradermal injection of 0.1 ml potassium hydroxide; ③, intradermal injection of 0.1 ml potassium hydroxide + FCA emulsion (1:1, v/v).
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관찰 및 평가

폐색첩포를 제거한 후, 남아있는 시험물질을 식염수로 세척하 고 21시간째에 제모한 다음, 24시간째와 48시간째에 피부반응 을 각각 평가기준에 의해 평가하여 기록하였다. 폐색첩포 제거 후, 24시간과 48시간에 개체별로 홍반 및 부종 반응을 Table 1의 피부반응 평가기준표에 따라 점수를 기록하고 투여군별 평 균점수를 구하였다. 피부감작성 평가는 전체 공시동물 중 피부 반응이 나타난 개체의 비율 (감작율 %)로 구하였으며, Table 2에 의해 시험물질의 피부감작성 정도를 분류하였다. 시험기간 중의 피부반응 이외에 전신적인 증상도 같이 기록하였다.
Table 1.
Response evaluation criteria for skin of guinea pigs
Score Skin response
0 No response
1 Scattered mild redness
2 Moderate and diffuse redness
3 Intense redness and swelling
Table 2.
Evaluation criteria for skin sensitization test using guinea pigs
Sensitization rate (%) Grade Classification
0 ? 8 I Weak
9 ? 28 II Mild
29 ? 64 III Moderate
65 ? 80 IV Strong
81 ? 100 V Extreme

결과 및 고찰

일반증상 및 체중변화

예비시험 (1, 2차 감작 유도) 및 감작야기 기간 동안 용매 대조군과 시험물질인 KOH 용액 투여군에서 일반증상은 관찰되 지 않았으며, 체중변화에서도 용매대조군에 비해 시험물질 투여 군에서 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다 (Table 3). 또한, 모든 시험군에서 사망한 실험동물은 관찰되지 않았다.
Table 3.
Body weight changes of guinea pigs during experiment
Group Weeks after treatment
1 2 3 4
Negative control1) 253.2±8.0 329.2±13.0 409.6±15.2 515.6±21.1
Positive control2) 255.6±9.1 321.4±21.7 385.6±12.0 476.4±14.6
KOH-treatment3) 256.0±9.3 336.4±8.0 415.4±11.9 510.0±13.7

1) Skin treated with the distilled water.

2) Skin treated with 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB).

3) Skin treated with potassium hydroxide (KOH).

감작항원량 및 야기항원량

KOH 용액을 농도별로 기니픽 2마리에 피내 주사한 다음 24 시간 후에 주사부위를 관찰한 결과, 괴사가 나타나지 않는 최대 농도인 감작항원량은 1.0%로 결정하였다. 1차 감작 1주 후 KOH 용액을 피내 주사했던 부위에 KOH 용액을 48시간 동안 폐색첩 포한 후, 폐색첩포 부위를 관찰한 결과, 2마리 기니픽 모두에서 홍반이 나타나지 않는 최대 농도인 야기항원량은 0.2%로 결정 하였다.

피부 감작성 평가

감작 야기 종료 후 24시간과 48시간에 각각 피부 반응을 평가 한 결과, 용매대조군과 시험물질 투여군에서 홍반 및 부종 등의 피부 반응이 관찰되지 않아 피부반응 점수는 모두 ‘0 (무반응)’으 로 나타났으며, 피부 감작율은 모두 0%로 나타나 용매 및 KOH 용액 (0.2%)는 모두 ‘I (매우약함)’등급으로 분류되었다. 한편, 양성대조군의 경우, 감작야기 종료 48시간 후에 피부반응 점수 는 ‘2.0 (홍반이 적용부위 전체에 나타남)’으로 나타났으며, 피부 감작율은 100%로 양성대조물질인 DCNB는 ‘V (매우 강함)’등 급으로 분류되었다 (Table 4, Fig. 2).
Table 4.
Sensitization scores and rates by challenge reaction 48 h after tropical application of potassium hydroxide
Group Substance for skin reaction
No. of animals Sensitization score
Mean response (24h/48h) Sensitization rate (%) Evaluation grade (classification)
Induction Challenge 24h 48h
Negative control Distilled water Distilled water 1 0 0 0/0 0 I
(weak)
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
Positive control 1% DNCB 0.1% DNCB 1 3 2 3/2 100 V
(extreme)
2 3 2
3 3 2
4 3 2
5 3 2
KOH treatment 1.0% KOH 0.2% KOH 1 0 0 0/0 0 I
(weak)
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0

DNCB, 2, 4-dinitrochlorobenzene; KOH, potassium hydroxide.

Fig. 2.
Skin reaction of potassium hydroxide at 48h after removal of the challenge patch. Representative pictures of skin reaction of solvent negative control group (A), positive control group (B) and potassium hydroxide-treatment group.
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앞선 연구에서 [5], 기니픽에 대해, 0.1% KOH로 감작을 유도 하고 감작을 야기한 후, 24, 48, 72시간 동안 관찰한 결과, 피부감 작을 일으키지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서 1.0% KOH로 감작을 유도하고 0.2% KOH로 감작을 야기한 결과, 피부감작을 일으키지 않아, 앞선 연구 [5]에 비해 다소 높은 농도에서도 KOH 가 피부감작을 일으키지 않는 것으로 확인되었다. 또한, European Chemical Agency (ECHA)는 KOH를 피부감작성을 일으키지 않는 물질로 분류하였다 [3].
이상의 연구 결과로부터, KOH (1.0%)는 기니픽에 대한 피부 반응이 없고, 피부 감작율이 매우 약한 ‘I’등급에 해당하여 피부 알러지를 유발하지 않는 물질로 확인되었다.

감사의 글

본 연구는 ㈜카브 (Seoul, Korea)의 연구지원비로 수행되었 으며, 이에 감사드립니다.

References

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